Por Dr. Pedro Serra
Hola a todos. Es un placer daros la bienvenida a esta sección en la que voy a colaborar como asesor científico.
Antes que nada, quiero agradecer a los gestores de esta web la oportunidad que se me brinda, así como la confianza depositada en mí para desarrollar este espacio. Espero estar a la altura de las circunstancias.
Dicho esto, me voy a presentar y a comentar brevemente mi experiencia. Soy el Dr. Serra, autor de 25 publicaciones científicas S.C.I. en el ámbito de la virología molecular, con una experiencia de 11 años como investigador en centros especializados de biología molecular de plantas. A nivel académico soy doctor por el departamento de biotecnología de la Universidad Politécnica de Valencia e ingeniero agrónomo de la especialidad de biotecnología y mejora vegetal.
Respecto al cannabis, comentaros que desde siempre he sido un apasionado de esta planta. De hecho, creo me decidí estudiar agrónomos después de leer el manual de auto-cultivo del cannabis de la A.R.S.E.C. y recuerdo que siempre reflejaba aquello que aprendía hacia el mundo de la marihuana.
Desde los 14 años he sido un porrero y un cultivador de esta planta, aunque mis cultivos nunca han sido un alarde ni de técnica ni de producción. A día de hoy, no puedo ni darle una calada a un porro porque me entran “yu-yus” mentales (Dr. Serra que estás mayor!!! Pues si).
En resumen, soy más o menos buen científico, un cultivador “regulero” y un exporrero venido a menos. Os cuento esto porque me viene al hilo de lo que quiero hacer en esta sección. Tras leer varios años revistas del sector, mi conclusión es que se habla y se repite mucho sobre técnicas de cultivo, agricultura ecológica, cuestiones de legalidad, asociaciones cannábicas…
Personalmente, siempre he echado en falta espacios y secciones de divulgación científica sobre el funcionamiento las plantas en general o del cannabis en particular y esto es un poco lo que quiero llevar a cabo en esta sección. La idea es comentar artículos científicos que entiendo que pueden ser relevantes e interesantes, explicando su idea principal, los experimentos que se realizan, las técnicas que se utilizan y las conclusiones a las que llegan, con un lenguaje sencillo y a ser posible ameno.
La divulgación es una parte esencial de la ciencia, especialmente para aquella que se financia con fondos públicos. Sin divulgación, el conocimiento generado queda relegado únicamente al ámbito científico y es necesario hacer un esfuerzo para que la gente sepa lo que se hace y los resultados que se obtienen con el dinero de sus impuestos. Todo buen científico debería ser un buen divulgador (o por lo menos intentarlo) y creo que en el mundo cannábico existe un público muy receptivo al conocimiento que tiene que ver con el funcionamiento de las plantas.
Después de esta declaración de intenciones, entramos en materia, y también deseo simplemente invitaros a participar, comentar, sugerir, discrepar o lo que os apetezca hacer para enriquecer esta sección que espero sea de vuestro agrado.
Atentamente: Dr. Serra
The inheritance of Chemical Phenotype in Cannabis sativa L.
Empezamos esta sección de divulgación científica comentando un artículo publicado en el año 2003 en la revista “Genetics” cuyo título es “The inheritance of Chemical Phenotype in Cannabis sativa L.”. Sus autores son (por orden de lista) Etienne P.M. de Meijer, Manuela Bagatta, Andrea Carboni, Paola Crucitti, V.M. Cristiana Moliterni, Paola Ranalli y Giuseppe Mandolino y puede descargarse gratuitamente en este enlace: http://www.genetics.org/content/163/1/335.full.pdf
Antes que nada quiero comentar algunas cosas que conviene tener en cuenta a la hora de leer un artículo científico. Lo primero es ver en qué revista se ha publicado. En este caso “Genetics” pertenece a la “Genetics Society of America” y este hecho es relevante ya que siempre es bueno que pertenezca a una sociedad regida por científicos.
Respecto a los parámetros que miden el prestigio de una revista científica decir que “Genetics” tiene un índice de impacto (impact factor) de 4,866 que la sitúa en el primer cuartil de su categoría, “Genetics & Heredity”. Estos datos indican que estamos ante una buena revista y por tanto publicar en ella conlleva elaborar un estudio bien realizado que genera conocimiento aportando aspectos relevantes y novedosos.
Dicho esto, decir que un artículo científico es bueno o malo por sí mismo, independientemente de la revista donde se publique.
Bueno pues vamos al lío. El artículo que quiero comentar nos habla de la segregación de quimiotipos de cannabis. Su título traducido sería algo parecido a “la herencia de los fenotipos químicos del cannabis” y tiene como autor principal a Etienne P.M. de Meijer y como jefe a Giuseppe Mandolino que a día de hoy siguen trabajando juntos en cuestiones relacionadas con los cannabinoides, en especial el THC y el CBD como muestra su último trabajo publicado en marzo.
El artículo que vamos a comentar es de formato estándar, lo que quiere decir que se subdivide en introducción, material y métodos, resultados y discusión. A estos apartados siempre hay que añadirles un resumen que tiene que contar todo el estudio realizado en unas pocas líneas y un apartado de referencias donde se indican las citas de la publicación.
En la introducción los autores nos cuentan los antecedentes y el conocimiento disponible hasta ese momento que sirve de punto de partida para el estudio que van a realizar. En ella se indica que el cannabis produce como metabolitos secundarios unas sustancias terpenofenólicas denominadas cannabinoides que se acumulan en los tricomas glandulares. Se conocen cerca de 60 cannabinoides diferentes siendo los más abundantes el cannabidiol (CBD) y el ∆-9-tetrahydrocannabinol (THC).
Según la cantidad de estos compuestos, el cannabis se puede clasificar en tres quimiotipos donde el quimiotipo I tiene un contenido superior al 0,3% de THC e inferior al 0,5% en CBD, el quimiotipo II con CBD como compuesto principal pero que también produce THC a diferentes concentraciones, y el quimiotipo III con un bajo contenido en THC. Se presume que los diferentes quimiotipos están asociados al origen geográfico de las distintas variedades de cannabis y se añade que raramente se encuentra, pero que existe, un quimiotipo IV con bajo contenido en THC y CBD pero con alto contenido en otro cannabinoide denominado cannabigerol (CBG).
A continuación el artículo nos introduce la ruta metabólica de síntesis de los cannabinoides. Esta ruta (ver figura ) parte de la unión del geranylpyrophosphato (1) y el ácido 2-olivotólico (2) por una transferasa (I) que forma CBG (3). A partir de esta molécula se pueden producir distintos cannabinoides dependiendo del enzima que catalice la reacción: la CBC sintasa (II) forma CBC (4), la THC sintasa (III) forma THC (5) y la CBD sintasa (IV) forma CBD (6).
El artículo comenta que existe una gran influencia ambiental en la cantidad de cannabinoides presentes, influyendo mucho el órgano de la planta que se trate y la etapa del ciclo de crecimiento en que se encuentre. Para discernir entre el efecto ambiental y la componente genética, el artículo propone una fórmula matemática donde la cantidad de cannabinoides por metro cuadrado de una plantación vendría determinada por el peso seco obtenido, la cantidad de inflorescencias, la cantidad total de cannabinoides en dichas inflorescencias y la pureza o proporción de un cannabinoide en concreto.
Según los autores, la única componente de esta fórmula que se rige según la ruta metabólica de la síntesis de cannabinoides, por tanto no está influenciada por el ambiente, sería la pureza o proporción de un cannabinoide en concreto. Las demás componentes tendrían un aspecto más cuantitativo lo que implica un carácter poligénico muy influenciado por el ambiente.
A continuación el artículo nos pone al corriente de trabajos anteriores en los que se ha estudiado la descendencia que se obtiene al cruzar parentales con distintos perfiles en la relación THC/CBD. Dichos estudios no son concluyentes pero sugieren que los quimiotipos parecen segregar de forma mendeliana.
En resumen, la introducción nos indica los distintos quimiotipos del cannabis según su perfil de cannabinoides, la ruta metabólica implicada, su influencia genética y el desconocimiento que existe en su herencia y transmisión.
Con estos antecedentes el objetivo del estudio es clarificar y poner orden en la segregación y herencia de los quimiotipos en cannabis. Para ello se realizarán cruces de líneas puras que solo producen THC o CBD y se analizará la F1 y la F2. Como segundo objetivo el estudio se plantea el diseño de marcadores moleculares que discriminen los distintos quimiotipos.
Pasamos a la sección de resultado que es donde realmente empieza el estudio.
La primera labor que realizan es analizar el perfil de cannabinoides de distintas líneas de cannabis mediante cromatografía de gases. Os pongo el enlace de un video que explica más o menos como funciona un cromatógrafo de gases
No quiero entrar mucho en detalle porque es una técnica que no domino, pero más o menos se obliga a un extracto purificado de cannabinoides a atravesar un recorrido sobre un gas inerte. La velocidad específica de cada molécula del extracto sobre el gas hace que se separen para finalmente llegar a un detector que capta la energía que emiten al ser volatilizadas por una llama. El resultado es un cromatograma donde cada pico identifica a una sustancia que viene determinada por el tiempo empleado en atravesar el recorrido. Este análisis también es cuantitativo ya que la altura del pico indica la cantidad. En el artículo se muestra la siguiente figura donde se pueden ver tres tipos de cromatogramas, uno para plantas que producen CBD, otro de plantas que producen THC y finalmente uno de plantas que producen ambos cannabinoides.
Una vez analizadas distintas líneas de cannabis, se seleccionan seis para realizar los ensayos, tres de ellas solo producen CBD y las otras tres solo THC. Como el objetivo es estudiar la segregación del cruce entre plantas que solo producen THC y plantas que solo producen CBD, los autores comprueban que se parte de líneas puras. Para ello, cada línea se auto-fecunda y se obtiene su descendencia (S1). De igual modo se auto-fecunda la S1 y se obtiene una segunda descendencia (S2). El análisis de los perfiles de cannabinoides por cromatografía muestra que tanto la S1 como la S2 mantienen el mismo perfil que las líneas originales usadas como parentales lo que confirma que se trata de líneas puras.
El siguiente paso es cruzar las líneas puras de CBD con las líneas puras de THC, obtener la F1 y analizar su perfil de cannabinoides. El resultado se muestra en la siguiente figura donde las F1 (representadas con triángulos) se sitúan en la diagonal de la gráfica indicando que producen tanto THC como CBD mientras que sus parentales (representados por cuadrados) se sitúan en los ejes indicando que solo producen THC o CBD. Todos los individuos de la F1 producen ambos cannabinoides.
Auto-cruzando la F1 se obtiene la F2 y al analizar su perfil de cannabinoides se obtiene el siguiente resultado.
En la gráfica los datos se agrupan en tres quimiotipos; plantas que solo producen THC (situadas en el eje de las ordenadas), plantas que al igual que la F1 producen ambos cannabinoides (situadas en la diagonal de la gráfica) y plantas que solo producen CBD (situadas en el eje de las abcisas). Por medio de un análisis de proporciones Chi cuadrado se comprueba una proporción 1:2:1 de los distintos quimiotipos.
En la discusión los autores proponen un modelo a partir de los resultados obtenidos. Dado que según los perfiles de cannabinoides la herencia se corresponde a una segregación monogénica mendeliana de tipo codominante, la interpretación que dan es que existe un locus que puede presentar tres tipos de alelos: BD que produce CBD, BT que produce THC y B0 no funcional.
De esta forma las plantas del quimiotipo I tendrían un genotipo homozigótico BT/ BT y solo produciran THC, las del quimiotipo II tendrían un genotipo heterozigótico BT/ BD y producirán THC y CBD, las del quimiotipo III tendrían un genotipo homozigoto BD/ BD y solo producirán CBD mientras que un genotipo homozigoto B0/ B0 no producirá ni THC ni CBD y estaría asociado al inusual quimiotipo IV descrito en la introducción.
Esta hipótesis también se apoya en las secuencias de la THC sintasa y de la CBD sintasa que comparten un 89% de homología. Dado que son muy parecidas los autores sugieren que estos enzimas tendrían un antecesor común (posiblemente uno de ellos) y que en algún momento de la evolución surgió un cambió que provocó la separación de estos isoenzimas.
El segundo objetivo del trabajo es el diseño de marcadores moleculares para determinar los distintos quimiotipos del cannabis.
Los marcadores moleculares son una herramienta que permite determinar los alelos y el locus que rigen un carácter. Os dejo un enlace de la wikipedia que lo explica muy bien.
Simplemente comentar que diseñar un marcador molecular es una tarea complicada ya que no se dispone de ninguna información acerca de la posición del locus en el genoma ni de cómo son de diferentes los alelos. En este caso, los autores utilizan los RAPDs que se basan en la amplificación aleatoria de segmentos del genoma y su correlación con los distintos fenotipos. Como disponen de plantas pertenecientes al genotipo I, II y III, a partir de sus extractos se realizan PCRs utilizando cebadores de secuencia aleatoria. La PCR es una herramienta fundamental y los marcadores moleculares suelen estar basados en ella. Os pongo un enlace de cómo funciona una PCR.
Una vez amplificadas aleatoriamente las regiones del genoma, se analizan por medio de una electroforesis. La electroforesis es otra herramienta fundamental en biología molecular y se basa en la separación de moléculas de un mismo extracto por su tamaño. En este caso, los productos de la PCR se depositan en un gel que se somete a un campo eléctrico. Como los ácidos nucleicos son moléculas de carga negativa, el campo eléctrico provoca su migración hacia el polo positivo pero al tener que atravesar el gel en el que están inmersas, las moléculas sufren un retraso en la migración dependiendo de su tamaño. Al finalizar la electroforesis y tras teñir el gel para visualizar los ácidos nucleicos se obtiene una serie de bandas que corresponde a los distintos tamaños moleculares.
En el artículo, los resultados que obtienen utilizando RAPDs son unas bandas que discriminan el quimiotipo I (solo THC) y el III (solo CBD) con tres de los cebadores cebadores empleados.
No es para tirar cohetes ya que no discriminan al 100%. Este marcador detecta todos los positivos pero algunos negativos los detecta como positivo. Secuenciando una de las bandas obtenidas con los RAPDs, los autores diseñan unos cebadores de secuencia concreta y así poder hilar más fino. Este tipo de marcador se denomina SCAR y el resultado tras utilizarlo es el siguiente:
Con este marcador se pueden discriminar el quimiotipo I (T), el quimiotipo III (C) y el quimiotipo II (H) que presenta las 2 bandas. Tampoco es para tirar cohetes ya que al igual que ocurre con los RAPDs, se producen falsos positivos en baja proporción. Al secuenciar las bandas obtenidas, los autores indican que no han amplificado regiones codificantes de la CBD sintasa o de la THC sintasa que son los enzimas implicados en la producción de ambos cannabinoides, pero sugieren que la región amplificada debe estar próxima a su locus dado que existe una correlación entre fenotipo y marcador y achacan los falsos positivos a sucesos de recombinación en la meiosis.
Bueno pues aquí acaba el artículo. He obviado algunos datos para no hacerlo más rollo pero creo que he comentado lo más interesante.
A modo de recapitulación, los autores proponen un modelo de segregación de quimiotipos de cannabis caracterizando los perfiles de cannabinoides de la descendencia obtenida a partir cruces entre líneas puras. Los autores sugieren un modelo mendeliano donde el perfil de cannabinoides viene determinado por un locus que puede tener tres alelos codominantes. Por otro lado diseñan unos marcadores moleculares que discriminan entre los distintos quimiotipos.
A mi es un artículo que me gusta mucho porque utilizando una única herramienta (en este caso un cromatógrafo de gases) y mucho ingenio se puede sacar mucha chicha (en este caso sientan las bases de la segregación de quimiotipos).
A día de hoy se sabe que la segregación no sigue exactamente el modelo aquí propuesto, a pesar de comportarse como un carácter monogénico mendeliano codominante como indica el artículo.
Respecto a la parte de los marcadores moleculares, este artículo es una evidencia de la dificultad y labor que conlleva su obtención. En la actualidad, existen herramientas más potentes que facilitan su diseño.
Ya para acabar, decir que a día de hoy este artículo se ha citado 58 veces lo cual indica la relevancia y repercusión que ha tenido.
Bueno, espero que os haya gustado. Saludos y hasta la próxima.